FCS (MMIC) - Microbiologia Clínica
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- Aspectos clínicos e epidemiológicos do surto de botulismo em bovinos confinados e alimentados com silagem de milho no Mato Grosso do Sul - BrasilPublication . Cardoso, Mary Barreto Lucena; Coelho, Maria JoãoOs surtos de botulismo em bovinos geram grande impacto na economia brasileira, uma vez que a bovinocultura é considerada uma das principais atividades econômicas do país, sendo atuante no cenário mundial do agronegócio. No presente trabalho são descritos os aspectos epidemiológicos, clínico-patológicos e laboratoriais do surto de intoxicação botulínica em bovinos de corte, alimentados com silagem de milho, ocorrido no Estado de Minas Gerais no período de 2 a 5 de agosto de 2017. A doença acarretou a morte de 1.100 bovinos precoces e preparados para o abate, consistindo uma alta taxa de letalidade e gerando ume perda econômica estimada em 2 milhões de reais para o pecuarista. Os animais apresentaram sinais e sintomas da doença, contribuindo para a resolução do diagnóstico clínico. Foram identificados dificuldade de deambulação, sinais clínicos de paralisia progressiva dos membros posteriores para os inferiores, hipotonia e sialorreia. Ausência de alterações neurológicas. Os animais permaneciam em decúbito lateral, paralisia cardiorrespiratória seguida de morte. O diagnóstico laboratorial constatou presença de toxina botulínica C e D em amostras de alimento servido ao gado e no soro bovino. Foram investigadas ainda presença de toxina em fragmentos do fígado, conteúdo ruminal e intestinal bovino que atestaram negativo. Além de amostras de água, ração e grãos de soja, que não continham a toxina. A existência de toxina na alimentação revela a importância da armazenagem e conservação corretas da silagem, de modo que não propicie um ambiente favorável para o desenvolvimento da bactéria Clostridium botulinum sendo fator de risco para a ocorrência de surtos.
- Atividade antimicrobiana de derivados da 5-amino-imidazol-4-carboxamidrazonaPublication . Gabriel, Carla Patrícia Morais Sequeira; Cerqueira, Fátima; Medeiros, RuiNas últimas décadas as infeções fúngicas têm-se tornado uma das principais causas de infeções hospitalares nos países desenvolvidos. Vários fatores, como a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), a neutropenia associada à quimioterapia anti-tumoral ou a imunossupressão induzida por fármacos, têm contribuído para o aumento das infeções fúngicas sistémicas oportunistas. Para além disso, as infecções fúngicas são um problema não apenas para indivíduos imunocompremetidos mas também para indivíduos saudáveis, devido ao aparecimento de estirpes multirresistentes. Por esta razão, as doenças fúngicas são actualmente consideradas um problema grave em todo o mundo. Neste sentido é importante a pesquisa e o desenvolvimento de novos antifúngicos de forma a melhor a eficácia das terapias convencionais. O objectivo deste trabalho consistiu na: (i) avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica de derivados da 5-amino-imidazol-4-carboxamidrazona, a sua relação estrutura actividade e elucidação do seu possível mecanismo de ação; (ii) determinação do efeito dos melhores compostos no sistema imune; (iii) avaliação da atividade destes sobre a formação de biofilme bem como contra biofilmes pré-estabelecidos, em substratos de nanohidroxiapatite. Os resultados obtidos demonstraram que os compostos estudados têm uma atividade muito limitada em Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli, mas são, no geral, providos de atividade antifúngica. Pela comparação das atividades em Candida albicans, C. krusei, C. parapsilosis e Cryptococcus neoformans foi possível, com base na relação estrutura/atividade, selecionar três compostos líderes, as (Z)-5-amino-N'-aril-1-metil-1H-imidazol-4-carbohidrazonamidas: [aril= fenil (2h), 4-fluorofenil (2k), 3-fluorofenil (2l)]. Os derivados de imidazol 2h, 2k e 2l inibiram fortemente o crescimento de C. krusei e C. neoformans embora a sua atividade em fungos filamentosos tivesse sido baixa quando comparado com a atividade em leveduras. Para além disso é de salientar a atividade fungicida dos compostos 2h e 2k contra C. krusei. No que se refere ainda ao mecanismo de ação antifúngica, 2h, 2k e 2l inibiram a atividade mitocondrial de C. krusei enquanto apenas o composto 2k foi capaz de o fazer quando se tratava de C. albicans. O composto 2h foi ainda capaz de inibir significativamente a transição dimórfica sendo que a formação do tubo germinativo é um importante fator de virulência de C. albicans. Relativamente à atividade no sistema imune, estes compostos apresentaram um efeito inibidor da proliferação de células mononucleares humanas estimuladas por fitohemaglutinina e da produção de óxido nítrico (NO) pela linha celular de macrófagos de ratinho RAW 264.7, após estimulação por Lipopolissacarídeo (LPS). Para além disso verificou-se uma acentuada redução na formação do biofilme por C. albicans e C. krusei em nanohidroxiapatite (nanoHA) particularmente para o composto 2l. Em conclusão estes compostos mostraram ter potencial para futura aplicação no tratamento de micoses provocadas por Candida sp e C. neoformans bem como no tratamento ou prevenção de infecções fúngicas associadas a dispositivos médicos. Além disso, podem permitir o desenho de novas estratégias para prevenção/tratamento de micoses oportunistas em doentes recetores de transplantes.
- Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados da espécie Rosmarinus officinalis LPublication . Guedes, Fabiana Salvatori; Abreu, Cristina; Grando, Luciana Grazziotin RossatoAs doenças transmitidas por alimentos ainda são consideradas um importante problema de saúde pública. Assim sendo, a indústria alimentícia recorre a diversas estratégias para promover a conservação e preservação dos alimentos, entre elas, o uso de aditivos alimentares, de origem natural ou sintética. O uso de antimicrobianos naturais como possíveis alternativas para inibir o crescimento de microrganismos patogénicos presentes em alimentos e estender seu prazo de validade vem sendo cada vez mais estudado. Os microrganismos endofíticos, são geralmente encontrados no interior de plantas, nas partes aéreas, como folhas e caule, e são capazes de produzir substâncias antimicrobianas e outros produtos de interesse biotecnológico. A espécie Rosmarinus officinalis L., conhecida popularmente como alecrim, possui propriedades antimicrobianas, principalmente em relação ao seu potencial efeito inibidor de microrganismos patogénicos em alimentos. Assim, o presente estudo, visa isolar e identificar os fungos endofíticos do alecrim e avaliar a sua atividade antimicrobiana.
- Avaliação dos perfis de resistência a antibióticos em Escherichia coli provenientes de infeções urinárias adquiridas na comunidadePublication . Marques, Bibiana Maria Lima; Sousa, João Carlos; Gomes, AlexandraAs infeções do trato urinário (ITU) são das infeções mais frequentes na comunidade, sendo E. coli o principal agente etiológico. O conhecimento da realidade epidemiológica no que concerne aos padrões de suscetibilidade aos vários antibióticos utilizados no tratamento de ITU é de extrema importância, permitindo assim a escolha mais adequada em contexto de terapia empírica. No tratamento da ITU são utilizados antibióticos de eliminação urinária, nomeadamente -lactâmicos, quinolonas, sulfanamidas, fosfomicina e nitrofurantoína, sendo os antibióticos do grupo dos -lactâmicos um dos mais utilizados no tratamento de infeções causadas por Escherichia coli. No entanto, com o surgimento de bactérias produtoras de -lactamases de espectro alargado (ESBLs), qAmpCs e/ou carbapenemases a eficácia deste grupo de antimicrobianos tem vindo a diminuir. Os genes codificantes destes mecanismos de resistência podem estar inseridos em elementos móveis (plasmídeos) que podem incluir também genes de resistência a outros grupos de antibióticos, limitando ainda mais as opções terapêuticas. Com a realização do presente trabalho pretende-se avaliar os padrões de suscetibilidade aos vários antibióticos utilizados no tratamento da ITU de 480 isolados de E. coli provenientes de amostras de urina de pacientes que requisitaram exame bacteriológico de urina em um laboratório da comunidade; investigar a ocorrência e a diversidade de genes que codificam para ESBLs (blaESBL) ou qAmpC (blaqAmpC) nos isolados identificados como presumíveis produtores de ESBLs e/ou qAmpC; assim como avaliar a co-resistência a antibióticos não -lactâmicos nos isolados produtores de ESBLs e/ou qAmpCs. A identificação da espécie bacteriana e a avaliação da susceptibilidade aos vários antibióticos foram realizadas utilizando o sistema automático VITEK®2 Systems. A caracterização dos isolados identificados como presumíveis produtores de ESBLs incluiu a realização do teste do duplo sinergismo e a identificação de genes blaESBL (blaTEM/blaSHV/blaCTX-M) por PCR e sequenciação. Nos isolados identificados como possíveis produtores de qAmpC foi realizada a identificação de genes blaqAmpC por PCR e sequenciação. Nos 480 isolados de E. coli estudados, 94% foram provenientes de pacientes do género feminino. A classe etária dos 61 aos 75 anos foi associada a uma maior ocorrência de ITU em ambos os géneros. Na avaliação da susceptibilidade aos diferentes antibióticos verificou-se uma elevada resistência à ampicilina (42,9%), ao trimetropim-sulfametoxazol (23,1%) e a antibióticos do grupo das quinolonas, destacando-se o ácido nalidixico (28,6%). As taxas de resistência à nitrofurantoína (1,7%) ou à fosfomicina (2,1%) foram baixas, pelo que ambos constituiram ainda alternativas eficazes no tratamento de ITU na comunidade. Nenhum isolado de E. coli apresentou resistência aos carbapenemos. A expressão de ESBLs foi observada em 3% (14/480) dos isolados de E. coli. Os genes blaESBL foram identificados como blaCTX-M (blaCTX-M-14 e blaCTX-M-15) (n=12) ou blaSHV (blaSHV-12) (n=2). Em 4 isolados de E. coli foi detetado um fenótipo compatível com a produção de qAmpC, sendo que em todos foi identificado o gene blaCMY-2. Verificou-se ainda a co-produção de ESBLs e qAmpC (blaSHV-12/blaCMY-2) (n=1). Em 12 dos isolados produtores de ESBLs e em 1 dos isolados produtores de qAmpC foram observados fenótipos de multiresistência. Este estudo demonstra que a disseminação na comunidade de E. coli resistentes a múltiplos antibióticos é uma realidade preocupante, limitando as opções terapêuticas e contribuindo para o insucesso do tratamento da ITU, sobretudo em contexto de terapia empírica.
- Disseminação horizontal de elementos de inserção cromossomal associados à resistência à ampicilina em E. faecium oriundos de diferentes nichos ecológicosPublication . Escada, Ricardo Jorge Ribeiro; Novais, CarlaNas últimas décadas, E. faecium tornou-se um dos agentes patogénicos nosocomiais mais comuns, estando associado ao globalmente disseminado complexo clonal 17 (CC17). O sucesso da subpopulação policlonal CC17 parece estar relacionada com a aquisição de características que aumentam a sua epidemicidade, algumas das quais maioritariamente associadas a esta linhagem genética. Essas características incluem a resistência a antibióticos (ex. ampicilina e fluoroquinolonas) ou uma maior capacidade em colonizar e infetar diferentes hospedeiros (fatores de virulência fms, esp, hyl, genes que codificam para algumas vias metabólicas). Enquanto a ocorrência de esp e hyl varia entre E. faecium-CC17, a maioria dos isolados apresenta níveis elevados de resistência à ampicilina. No entanto, a disseminação horizontal da resistência a este antibiótico (mediada pelo gene pbp5) é um processo ainda pouco explorado. Assim, o objetivo principal deste estudo consistiu em estudar a mobilização de pbp5 a partir de E. faecium oriundos de vários nichos ecológicos e caracterizar as plataformas genéticas móveis que transportam este gene. A transferência horizontal da ampicilina foi detetada entre bactérias selvagens de várias origens (hospital e comunidade) e bactérias recetoras com diferentes contextos genéticos (pbp5+/pbp5-; diferentes STs). Todas as bactérias selvagens que disseminaram o gene pbp5 pertenciam ao CC17. A resistência à ampicilina persistiu nas estirpes selvagens e nos transconjugantes mesmo na ausência de pressão seletiva. A expressão da resistência à ampicilina foi variável (CMI=8-128mg/L) nos transconjugantes e a cotransferência da resistência a outros antibióticos (ex. vancomicina, eritromicina, estreptomicina) também foi detetada. O gene pbp5 adquirido foi identificado em bandas cromossomais de elevado e variável tamanho (170-250kb) em E. faecium selvagens e em todos os transconjugantes obtidos. Nas bactérias recetoras pbp5+ esta transferência horizontal não implicou, em todos os casos, a substituição da plataforma natural que contém pbp5, e os rearranjos no DNA ocorreram com frequência e diversidade em diferentes transconjugantes. A caracterização do ambiente genético de pbp5 e a análise in silico de sequências disponíveis em bases de dados (GenBank) permitiu a identificação de cinco plataformas genéticas distintas (I-V), diferenciadas pela presença de sequências de inserção (ISEf1, ISEfa11), fragmentos genómicos (ISEfm1+acetiltransferase+histidinol fosfato fosfatase) ou do transposão conjugativo Tn5382. Algumas destas plataformas (I, II, IV) eram comuns em E.faecium de diferentes nichos ecológicos, STs e países. Contrastando com outros estudos, os E. faecium portugueses não possuíam plataformas com os transposões conjugativos CTn5382, CTn5386 ou CTn916, anteriormente associados à transferência horizontal de pbp5. A presença de um elevado polimorfismo (traduzindo-se em alterações aminoacídicas cujas combinações foram designadas de C1 a C12) foi observado entre as sequências de pbp5 analisadas oriundas de E. faecium que transferiram pbp5. Esta variabilidade pode refletir a disseminação de um fragmento de DNA portador de pbp5 de elevado tamanho que evoluiu independentemente em diferentes hospedeiros que estão sob pressão seletiva. Esta hipótese é sugerida pela variabilidade de sequências de pbp5 localizadas em regiões com um conteúdo em IS semelhante e pertencendo a linhagens genéticas próximas (STs de CC17 que são SLV entre eles). A manutenção do elemento genético portador de pbp5 adquirido na ausência de pressão seletiva e a sua transferência sob concentrações subinibitórias de ampicilina pode explicar a rápida expansão da resistência a este antibiótico entre E. faecium nosocomiais ao longo das últimas décadas. O uso intensivo de ampicilina pode também contribuir para a disseminação da resistência a outros antibióticos e para a manutenção e evolução de E. faecium-CC17 em diferentes hospedeiros e nichos ecológicos. In the last decades, E. faecium has become one of the most common nosocomial pathogens, associated with the disseminated worldwide clonal complex 17 (CC17). The success of the CC17 subpopulation seems to be related to the acquisition of features increasing its epidimicity, some of which mostly associated with this CC. They include antibiotic resistance (e.g. ampicillin and fluoroquinolones) or a greater ability to colonize and infect different hosts (virulence factors coded by fms, esp hyl, genes coding for some metabolic pathways). While the occurrence of esp and hyl genes is variable among E. faecium-CC17, all isolates show resistance to ampicillin. However, the horizontal spread of the genes codifying for the resistance to this antibiotic (pbp5 gene) remains scarcely explored. Thus, the main objective of this study was to study the mobilization of pbp5 from E. faecium of different ecological niches and to characterize the genetic mobile platforms carrying this gene. The horizontal transfer of ampicillin was detected between wild bacteria from various sources (hospital and community) and recipient bacteria with different genetic contexts (pbp5+/pbp5-; different STs). All the wild E. faecium transferring pbp5 gene belonged to CC17. Ampicillin resistance persisted in wild strains and transconjugants, even in the absence of selective pressure. The expression of ampicillin resistance was variable (MIC 8-128mg/L) in the different transconjugants and the cotransfer of resistance to other antibiotics (e.g. vancomycin, erythromycin, streptomycin) was also detected. The acquired pbp5 gene was chromosomal located and bands of high and variable sizes (170-250kb) were detected among wild strains and transconjugants. In pbp5+ receptor bacteria this horizontal transfer did not seem to replace the natural platform containing pbp5 in all cases, and rearrangements in the DNA were frequent and diverse among transconjugants. The characterization of pbp5 genetic environment and the in silico analysis of sequences available in genetic databases (GenBank) allowed the identification of five distinct genetic platforms (I-V), distinguished by the presence of insertion sequences (ISEf1, ISEfa11) genomic fragments (ISEfm1+acetyltransferase+histidinol phosphate phosphatase) or the conjugative transposon Tn5382. Some of these plataforms (I, II, IV) were common among E .faecium from different ecological niches, STs and countries. In contrast to other studies, Portuguese E. faecium did not carry platforms with the conjugative transposons CTn5382, CTn5386 or CTn916, previously associated with horizontal transfer of pbp5. The detection of a high polymorphism (translated in amino acid alterations which combinations were named C1 to C12) was detected among the aquired pbp5 sequences. This variability may reflect the dissemination of a large DNA fragment carrying pbp5, which evolved independently in different hosts that are under selective pressure. This hypothesis is suggested by the sequence variability of pbp5 sequences located in regions with a similar IS content and belonging to closed genetic lineages (CC17 STs that are SLV from each other). The maintenance of the acquired pbp5-platform in the absence of selective pressure and their transfer under ampicillin subinibitory concentrations may explain the rapid expansion of resistance to this antibiotic among nosocomial E. faecium over the past decades. The intensive use of ampicillin can also contribute to the spread of resistance to other antibiotics and consequently to the maintenance and evolution of E. faecium- CC17 in different hosts and ecological niches.
- Enterobacteriaceae resistant to extended-spectrum β- lactam antibiotics in different settings in Portugal: towards an epidemiological characterization of a Public Health priorityPublication . Rodrigues, Carla Alexandra Parada; Amorim, Ângela Patricia da Silva Novais; Machado, ElisabeteO aumento de β-lactamases de espetro alargado (ESBLs) e carbapenemases quer a nível hospitalar quer a nível da comunidade tem vindo a comprometer a utilização dos antibióticos β-lactâmicos no tratamento de infeções causadas por Enterobacteriaceae. Em Portugal, uma elevada ocorrência de ESBLs tem sido reportada enquanto que algumas carbapenemases foram apenas recentemente identificadas. Contudo, os dados epidemiológicos recentes sobre a ocorrência e diversidade de Enterobacteriaceae produtoras de ESBLs e/ou carbapenemases em Portugal são escassos. O principal objetivo deste estudo é caraterizar a diferentes níveis a epidemiologia molecular de isolados recentes de Enterobacteriaceae (2006-2010) resistentes a cefalosporinas de espetro alargado e/ou carbapenemos, provenientes de diferentes nichos ecológicos (hospitais, suiniculturas). Trezentos e dois isolados de Enterobacteriaceae obtidos entre 2006 e 2010 de diferentes origens (5 hospitais, 2 suiniculturas), foram analisados. Estes isolados incluíam: i) 264 isolados produtores de ESBLs de 3 hospitais; ii) 16 isolados com redução da suscetibilidade aos carbapenemos de 2 hospitais e iii) 22 isolados produtores de ESBLs de animais, rações e ambiente de 2 suiniculturas Portuguesas. A identificação bacteriana e o estudos de suscetibilidade a antibióticos foram efectuados por métodos clássicos. Os genes que codificam para ESBL ou carbapenemases e o seu ambiente genético foram identificados por PCR (blaCTX-M, blaSHV, blaTEM, blaKPC, blaMBL, blaOXA) e sequenciação. A relação clonal entre isolados foi estabelecida por XbaI-PFGE e MLST. A análise de plasmídeos incluiu a identificação de grupos de incompatibilidade por PCR, sequenciação e hibridação, RFLP e pMLST. As alterações em porina foram investigados por PCR e SDS-PAGE. A resistência a cefalosporinas de espetro alargado foi frequentemente associada a Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, mas também a Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis e Serratia marcescens. Foi detetada uma grande diversidade de ESBLs, sendo que as enzimas do tipo CTX-M (CTX-M-1, -2, -9, -14, -15, -32, -79) e SHV (SHV-2, -5, -12, -28, -55, -106, -145) foram as mais predominantes em E. coli e K. pneumoniae respetivamente, enquanto que as enzimas do tipo TEM foram detetadas com menor frequência (TEM-10, -24, -52, -116, -199) em diferentes espécies de enterobactérias. Apesar de ter sido observada uma elevada diversidade clonal (264 isolados/86 pulsotipos), foram identificados clones epidémicos de E. coli (ST131) e K. pneumoniae (ST15, ST147, ST336) associados à disseminação de determinadas ESBLs (CTX-M-15, diferentes variantes de SHV) durante longos períodos de tempo em diferentes hospitais. Neste estudo, foi identificado um reservatório de genes blaCTX-M-1/-32 e blaTEM-52 em suiniculturas Portuguesas associado à disseminação de plasmídeos (IncI1/ST3 e IncN, respetivamente) e clones (E. coli complexo clonal 10) epidémicos frequentemente identificados em humanos e outros animais em diversos países. Foram identificados isolados com suscetibilidade reduzida aos carbapenemos em: i) um surto nosocomial que envolveu diferentes espécies de Enterobactericeae com alterações em porinas e produção de ESBLs ou AmpCs plasmídicas; e ii) um isolado clínico de K. pneumoniae (ST15) produtor de uma nova variante de VIM-1, designada VIM-34. Neste trabalho é descrita uma epidemiologia complexa entre as Enterobacteriaceae produtoras de ESBLs em Portugal, envolvendo uma diversidade de ESBLs, clones (alguns contendo genes blaESBL filogeneticamente relacionados) e plasmídeos. A identificação de plasmídeos e clones idênticos produtores de ESBL entre isolados de origem humana e animal sugere um papel relevante da cadeia alimentar na disseminação de bactérias produtoras de ESBLs. A deteção de isolados com suscetibilidade diminuída aos carbapenemos (devido à produção de carbapenemases ou ESBL/AmpC e alterações em porina) pertencentes a clones epidémicos em hospitais Portugueses foi importante para implementar medidas de controle de infeção adequadas e oportunas e reforçar os sistemas de vigilância. The expansion of extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) and carbapenemases in both nosocomial and community settings has seriously compromised the use of β- lactam antibiotics in the treatment of infections caused by Enterobacteriaceae. In Portugal, a high occurrence of ESBLs has been reported and carbapenemase-producing isolates have recently emerged, although recent epidemiological data on the occurrence, diversity, and epidemiological features of ESBL- or carbapenemase-producing Enterobacteriaceae are scarce. The global goal of this study is the multi-level molecular epidemiological characterization of recent Enterobacteriaceae isolates (2006-2010) resistant to extended-spectrum cephalosporins and/or carbapenems obtained from different ecological niches (hospitalized patients, pig farms). Three hundred and two Enterobacteriaceae isolates obtained from different sources (5 hospitals, 2 piggeries) between 2006 and 2010 were studied. They included i) 264 ESBL-producing isolates from 3 hospitals; ii) 16 isolates with reduced susceptibility to carbapenems from 2 hospitals; and iii) 22 ESBL-producing isolates from animals, feed and environmental samples of two Portuguese piggeries. Bacterial identification and antibiotic susceptibility testing were performed by standard methods. ESBL or carbapenemase genes and their genetic environment were identified by PCR (blaCTX-M, blaSHV, blaTEM, blaKPC, blaMBL, blaOXA) and sequencing. Clonal relatedness was established by XbaI-PFGE and MLST. Plasmid analysis included identification of incompatibility groups by PCR, sequencing and hybridization, RFLP and pMLST. Porin changes were investigated by PCR and SDS-PAGE. Resistance to extended-spectrum cephalosporins was mostly observed in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, and also Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis and Serratia marcescens. A high diversity of ESBLs was detected, mostly from CTX-M (CTX-M-1, -2, -9, -14, -15, -32, -79) and SHV-types (SHV-2, -5, -12, -28, -55, -106, -145), particularly among E. coli and K. pneumoniae isolates, respectively, while the TEM-type enzymes were sporadically reported (TEM- 10, -24, -52, -116, -199) in different Enterobacteriaceae species. Despite the high clonal diversity observed (264 isolates/86 PFGE-types), a few epidemic E. coli (ST131) and K.pneumoniae (ST15, ST147, ST336) clones were associated with the dissemination of particular ESBL-types (CTX-M-15, different SHV-variants) during large periods of time in different hospitals. CTX-M-1/-32 or TEM-52 types were detected among Portuguese piggeries associated with the spread of epidemic plasmids (IncI1/ST3 and IncN, respectively) and clones (E. coli clonal complex 10), frequently identified in humans and other animals in several countries. Reduced susceptibility to carbapenems was detected: i) in a nosocomial outbreak involving different ESBL or plasmidmediated AmpC-producing Enterobacteriaceae isolates exhibiting porin alterations; and ii) in a ST15 K. pneumoniae clinical isolate producing a novel VIM-1 variant, designated VIM-34. A complex epidemiology of ESBL-producing Enterobactericeae in Portugal is described, with the involvement of a diversity of ESBL-types, epidemic clones (in some cases harbouring closely related blaESBL genes) and plasmids. The identification of identical ESBL-encoding plasmids and clones between isolates from human and animal origins stresses a link through the food chain. The detection of strains with decreased susceptibility to carbapenems (either by carbapenemase production or ESBL/AmpC production plus porin changes) belonging to widespread clones in Portuguese hospitals was important to implement appropriate and timely infection control measures, and to reinforce continuous surveillance systems.
- Epidemiologia de β-Lactamases adquiridas do tipo AmpC em isolados clínicos humanos de EnterobacteriaceaePublication . Freitas, Francisco José Oliveira; Machado, Elisabete; Peixe, Luísa VieiraOs β-lactâmicos constituem antibióticos de primeira linha no tratamento de infecções causadas por Enterobacteriaceae, mas a resistência a estes compostos tem aumentado progressivamente, sendo uma das principais causas a produção de β-lactamases. Nestas incluem-se as AmpC adquiridas (qAmpC), cujos genes codificantes coexistem habitualmente com genes de resistência a outros antibióticos na mesma plataforma genética, limitando as opções terapêuticas. O objectivo global do presente trabalho consistiu em analisar a contribuição da expansão clonal e da transferência horizontal de genes na disseminação de Enterobacteriaceae produtoras de qAmpC (sem AmpC indutivel). Foram analisados 675 isolados clínicos provenientes de 5 instituições de saúde Portuguesas (Norte e Centro). A identificação bacteriana e a avaliação da susceptibilidade aos antibióticos foram realizadas por métodos universalmente aceites. A caracterização das qAmpC incluiu a realização do teste do ácido borónico, o teste do duplo sinergismo entre cefoxitina e a ceftazidima ou a cefotaxima, e a identificação de genes blaqAmpC por PCR e sequenciação. Efectuou-se também a análise da estrutura populacional, da transferibilidade de blaqAmpC, e análise plasmídica. O ambiente genético em torno dos genes blaqAmpC foi também pesquisado (PCR, sequenciação). A expressão de AmpC foi observada em 59% (59/100) dos isolados identificados como presumíveis produtores de qAmpC, detectando-se apenas entre os isolados resistentes à cefoxitina (66%, 59/89). Em 50% (50/100) dos isolados detectaram-se dois tipos distintos de genes blaqAmpC, identificados como blaDHA-1 (94%, n=47/50) e blaCMY-2 (6%, n=3/50). A co-produção de β-lactamases de espectro alargado (ESBLs), predominantemente do tipo SHV, é comum entre os isolados produtores de qAmpC. Reportam-se associações de genes blaqAmpC e blaESBL nunca antes descritas. Em todos os isolados produtores de qAmpC se observou fenótipo de multirresistência, verificando-se elevadas taxas de resistência à maioria dos antibióticos: canamicina (98%), tobramicina (96%), sulfonamidas (96%), ceftazidima (94%), cefotaxima (88%), aztreonamo (84%), ciprofloxacina (82%), trimetoprim (80%), cloranfenicol (78%) e tetraciclina (70%). Os antibióticos com menores taxas de resistência foram: o meropenemo (0%), o imipenemo (4%), a cefepima (8%), a tigeciclina (8%) e a amicacina (26%). Genes blaDHA-1 ocorreram em diferentes espécies, K. pneumoniae (n=41), K. oxytoca (n=4) e E. coli (n=2), durante todo o período de estudo e na maioria das instituições analisadas, verificando-se uma grande diversidade clonal (n=14). Entre os isolados de K. pneumoniae produtores de DHA-1 foram identificados os clones ST11 (n=14, 2 tipos de PFGE) e ST443 (n=1), nos quais se confirmou a presença de blaDHA-1 em plasmídeos não transferíveis pertencentes ao grupo de incompatibilidade IncR (50kb e 180 kb, respectivamente). Em K. oxytoca e E. coli blaDHA-1 detectou-se em plasmídeos não transferíveis pertencentes ao grupo de incompatibilidade IncHI2 (300 e 350 kb, respectivamente) Estas associações nunca antes foram descritas. Genes blaCMY-2 ocorreram apenas em E. coli (n=3), durante o período 2006-2007 e apenas em duas das instituições analisadas, verificando-se a presença de distintos clones (n=3) pertencentes ao grupo filogenético B1. Em dois clones, um dos quais da linhagem clonal ST101, blaCMY-2 foi encontrado em plasmídeos conjugativos de incompatibilidade IncK de 80 kb, enquanto no terceiro clone (B1-fumC65) blaCMY-2 se detectou em plasmídeos não transferíveis de incompatibilidade IncA/C2 de 150 kb. A epidemiologia de isolados produtores de qAmpCs em Portugal é complexa, parecendo envolver a disseminação de clones e/ou plasmideos no caso de blaDHA-1, e predominantemente plasmídeos, mas também sequências de inserção do tipo ISEcp1 no caso de blaCMY-2.
- Estudo da adesão bacteriana a biomateriais nanofásicosPublication . Grenho, Liliana do Carmo Santos; Ferraz, Maria Pia; Monteiro, Fernando JorgeA adesão bacteriana inicial à superfície de um biomaterial é uma etapa importante na patogénese das infecções protéticas que pode conduzir à formação do biofilme. As bactérias organizadas em biofilme são mais resistentes aos antibióticos e encontram-se menos acessíveis ao sistema imunitário do hospedeiro. Infelizmente, a falta de tratamentos adequados deixa, frequentemente, a extracção do dispositivo contaminado como a única opção viável para a eliminação do biofilme. A nanohidroxiapatite (nanoHA) é um fosfato de cálcio que tem sido estudada para o uso na regeneração óssea devido às suas similaridades com os tecidos duros do corpo. Este trabalho teve como objectivo a avaliação da adesão inicial de estirpes bacterianas clinicamente importantes, pertencentes às espécies S. aureus, S. epidermidis e P. aeruginosa, a materiais de nanoHA sinterizados a 725C e 1000C. Para além da análise da contribuição do fenótipo bacteriano e da origem da estirpe para o processo de adesão, foi igualmente avaliada as repercussões que o tratamento térmico aplicado aos materiais teve na hidrofobicidade e rugosidade da superfície dos mesmos e, consequentemente, nos perfis de adesão bacteriana. Materiais de microhidroxiapatite (microHA) sujeitos aos mesmos tratamentos térmicos foram utilizados como material controlo. A adesão bacteriana inicial foi avaliada aos 30, 60 e 90 minutos de contacto após os quais as células aderidas foram observadas no microscópio electrónico de varrimento e libertadas do material por sonicação para quantificação por contagem das unidades formadoras de colónias. A hidrofobicidade e a rugosidade da superfície dos materiais foram determinadas através da medição do ângulo de contacto, utilizando a técnica da gota séssil, e por microscopia de força atómica, respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que a nanoHA sinterizada a 1000C foi menos susceptível de adesão bacteriana comparativamente com nanoHA 725. Em relação ao fenótipo e origem bacteriana, as estirpes isoladas de infecções ósseas mostraram-se mais aptas para aderir apresentando maiores valores de adesão bem como maior capacidade de produção de slime. Quanto se procedeu à análise das propriedades da superfície dos materiais, verificou-se que o aumento da temperatura de sinterização resultou num aumento da hidrofobicidade e da rugosidade. Adesão bacteriana foi maior nos materiais mais hidrofílicos e não foi possível estabelecer uma relação entre a adesão e a rugosidade média da superfície analisada. Initial bacterial adhesion to biomaterial surfaces is a crucial step in the pathogenesis of prosthetic infection that can lead to biofilme formation, which enhanced resistance of bacteria against host defense mechanisms and antibiotic treatments. Unfortunately, the lack of a suitable treatment often leaves extraction of the contaminated device as the only viable option for eliminating the biofilm. Nanohydroxyapatite (nanoHA) is a calcium phosphate that has been studied aiming at being used as bone regeneration material due to its chemical similarities to the inorganic component of the body’s hard tissues. This work aimed at evaluating the initial adhesion of several strains namely S. aureus, S. epidermidis and P. aeruginosa, to nanoHA heat-treated at 725C and 1000C. The influences of bacterial phenotype and origin on bacterial adhesion were evaluated, as well as the impact of the heat-treatment on material surface hydrophobicity and roughness and, consequently, on the bacterial adhesion profiles. MicroHA subjected to the same heat-treatment was used as control. The evaluation of initial bacterial adhesion was performed for 30, 60 and 90 minutes after which adhering cells were observed by scanning electron microscopy and released by gentle sonication to be quantified by colony forming units. Materials surfaces hidrophobicity and roughness were determined through contact angle measurements via sessile drop technique and atomic force microscopy, respectively. According to the results, nanoHA heat-treated at 1000C showed, for all studied strains, the lowest adhesion values. In relation to bacterial phenotype and origin, the strains isolated from orthopedic infections presented increased ability to adhere to the materials as well as better capacity to produce slime. Concerning substrata surface properties, it was found that increasing the sintering temperature resulted in increased hydrophobicity and roughness. The bacterial adhesion was greater in the more hydrophilic materials and no relationship was found between bacterial adhesion and roughness.
- Estudo da eficácia de óleos essenciais na melhoria da qualidade microbiológica do ar interiorPublication . Barroso, Felipe Augusto Stahlschmidt; Abreu, CristinaA qualidade do ar é um fator essencial para a qualidade de vida e saúde humana. Na sociedade contemporânea, verifica-se uma preocupação de nível mundial com relação ao poluentes atmosféricos, químicos e biológicos. O ar interior é em grande parte proveniente do exterior, e em alguns locais como laboratórios de aulas de microbiologia, o ar interior encontra-se contaminado com bioaerossois. Os óleos essenciais que são extratos naturais de plantas aromáticas, têm sido utilizados na medicina popular há séculos, e há algumas décadas tem cada vez mais despertado o interesse de investigadores por serem constituídos por compostos com diversas finalidades como antimicrobiana. O objetivo do trabalho foi avaliar a eficácia dos óleos essencias na eliminação das bactérias presentes no ar dos laboratórios da Universidade Fernando Pessoa, usados nas aulas de microbiologia. Pretende-se assim contribuir para uma melhoria na qualidade microbiológica do ar interior dos laboratórios. Inicialmente foi realizada uma caracterização dos laboratórios, relativamente ao tipo de bioaerossóis presentes no ar. Posteriormente, foram colhidas amostras de ar antes de depois de aplicação da mistura de óleos essenciais. Após a contagem de Unidades Formadoras de Colónia formadas após incubação dos meios de cultura, cada morfotipo de colónia foi repicado em meio cromogénico e caracterizado relativamente ao Gram. Os resultados demonstraram a eficácia do spray de óleos essenciais, sendo que em algumas amostragens houve uma diminuição superior a 40% no número de UFC. Com isso, concluímos que a mistura de óleos essenciais utilizada, teve uma boa eficácia e contribui para a melhoria da qualidade do ar interior.
- Identificação de Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia isoladas de pacientes com doença periodontal e análise das resistências antimicrobianasPublication . Cunha, Carminda Sílvia Nunes Monteiro da; Pina, Cristina; Cardoso, Inês LopesA cavidade oral é um dos locais do organismo humano que revela a mais complexa e heterogénea população microbiana, da qual fazem parte mais de meio milhar de espécies bacterianas. A doença periodontal (DP) é uma patologia oral de origem bacteriana caracterizada por um estado inflamatório que começa por afetar o tecido gengival e cuja progressão leva frequentemente à perda de dentes na idade adulta. As gengivites e periodontites são das patologias periodontais que surgem com maior predomínio na rotina da clinica dentária. A identificação do microbioma responsável por este tipo de patologias é extremamente importante na adoção de medidas mais eficazes, quer de tratamento, quer de prevenção. Certas estirpes de bactérias de Gram negativo têm sido encontradas de forma consistente em lesões periodontais, nomeadamente as espécies Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia. Estas bactérias são de Gram negativo, anaeróbias estritas, imóveis, não esporuladas e produtoras de pigmento negro. A identificação destes microrganismos pode ser realizada pelos métodos convencionais, sendo tecnicamente complexos, dispendiosos e morosos ou por diversas técnicas de biologia molecular, nomeadamente a Polymerase Chain Reaction (PCR). A prevenção e o controlo das doenças periodontais residem na eliminação do biofilme microbiano, através de hábitos de higiene oral e tratamento mecânico local. No entanto, em alguns tipos de DP torna-se necessário o uso de antisépticos e/ou antibióticos. A identificação das espécies bacterianas implicadas na DP permite a prescrição do antibiótico específico, uma vez que se tem verificado uma tendência para a abordagem terapêutica empírica o que tem conduzido para um aumento da resistência aos antibióticos, particularmente nas espécies do género Porphyromonas e Prevotella. Face ao exposto e à escassa informação acerca da identidade de estirpes bacterianas em infecções periodontais em Portugal e eventuais resistências desenvolvidas realizou-se um estudo preliminar de pesquisa das estirpes produtoras de pigmento negro, nomeadamente P.gingivalis e P. intermedia e da pesquisa da suscetibilidade antimicrobiana aos antibióticos β-lactâmicos, metronidazol, clindamicina e tetraciclina; assim como também, a pesquisa de enzimas β-lactamases. Neste trabalho foram analisadas 42 amostras de isolados subgengivais provenientes de pacientes com periodontites, da clínica dentária da Faculdade de Ciências da Saúde, da Universidade Fernando Pessoa, Porto. Das 42 amostras, apenas 14 tiveram crescimento de colónias com pigmento negro. Destas, 57,1% foram identificadas como P. intermedia, 28,6% eram P. gingivalis e 14,2% pertenciam a outras espécies pigmentadas. Relativamente à prova de sensibilidade antimicrobiana, verificou-se que todas as amostras de P. intermedia foram sensíveis aos antibióticos testados, embora 14,3% de Prevotella spp tenha-se mostrado resistente à penincilina, amoxicilina, clindamicina e tetraciclina. Nenhum dos isolados da espécie P. gingivalis mostrou resistência aos agentes antimicrobianos ensaiados. A pesquisa de β-lactamases revelou que apenas 2 amostras tinham capacidade para a produção destas enzimas. Os dois métodos utilizados neste trabalho mostraram-se eficazes no conhecimento das espécies bacterianas intervenientes na DP. Contudo, no método clássico várias amostras perderam viabilidade durante o processo de congelação, inviabilizando a sua cultura. Por outro lado, os métodos moleculares amplificaram todas as amostras tendo-se demonstrado como previsto uma técnica rápida e precisa. As estirpes isoladas de P. gingivalis e P. intermedia foram sensíveis a todos os antibióticos testados, ao contrário do referido na literatura. Este resultado pode dever-se à reduzida amostragem deste estudo. Da avaliação destes resultados preliminares é nossa proposta em estudos futuros alargar significativamente a amostragem, bem como a amplificação direta do ADN bacteriano colhido nas bolsas periodontais, de forma a não existir seleção cultural dos agentes microbianos. O estudo da suscetibilidade antimicrobiana com recurso a técnicas de biologia molecular é, também nossa proposta para a contribuição de uma maior sensibilidade e precisão de resultados.