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Disseminação horizontal de elementos de inserção cromossomal associados à resistência à ampicilina em E. faecium oriundos de diferentes nichos ecológicos
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Nas últimas décadas, E. faecium tornou-se um dos agentes patogénicos nosocomiais
mais comuns, estando associado ao globalmente disseminado complexo clonal 17
(CC17). O sucesso da subpopulação policlonal CC17 parece estar relacionada com a
aquisição de características que aumentam a sua epidemicidade, algumas das quais
maioritariamente associadas a esta linhagem genética. Essas características incluem a
resistência a antibióticos (ex. ampicilina e fluoroquinolonas) ou uma maior capacidade
em colonizar e infetar diferentes hospedeiros (fatores de virulência fms, esp, hyl, genes
que codificam para algumas vias metabólicas). Enquanto a ocorrência de esp e hyl varia
entre E. faecium-CC17, a maioria dos isolados apresenta níveis elevados de resistência à
ampicilina. No entanto, a disseminação horizontal da resistência a este antibiótico
(mediada pelo gene pbp5) é um processo ainda pouco explorado. Assim, o objetivo
principal deste estudo consistiu em estudar a mobilização de pbp5 a partir de E. faecium
oriundos de vários nichos ecológicos e caracterizar as plataformas genéticas móveis que
transportam este gene.
A transferência horizontal da ampicilina foi detetada entre bactérias selvagens de várias
origens (hospital e comunidade) e bactérias recetoras com diferentes contextos
genéticos (pbp5+/pbp5-; diferentes STs). Todas as bactérias selvagens que disseminaram
o gene pbp5 pertenciam ao CC17. A resistência à ampicilina persistiu nas estirpes
selvagens e nos transconjugantes mesmo na ausência de pressão seletiva. A expressão
da resistência à ampicilina foi variável (CMI=8-128mg/L) nos transconjugantes e a
cotransferência da resistência a outros antibióticos (ex. vancomicina, eritromicina,
estreptomicina) também foi detetada. O gene pbp5 adquirido foi identificado em bandas
cromossomais de elevado e variável tamanho (170-250kb) em E. faecium selvagens e
em todos os transconjugantes obtidos. Nas bactérias recetoras pbp5+ esta transferência
horizontal não implicou, em todos os casos, a substituição da plataforma natural que
contém pbp5, e os rearranjos no DNA ocorreram com frequência e diversidade em
diferentes transconjugantes. A caracterização do ambiente genético de pbp5 e a análise in silico de sequências
disponíveis em bases de dados (GenBank) permitiu a identificação de cinco plataformas
genéticas distintas (I-V), diferenciadas pela presença de sequências de inserção (ISEf1,
ISEfa11), fragmentos genómicos (ISEfm1+acetiltransferase+histidinol fosfato fosfatase)
ou do transposão conjugativo Tn5382. Algumas destas plataformas (I, II, IV) eram
comuns em E.faecium de diferentes nichos ecológicos, STs e países. Contrastando com
outros estudos, os E. faecium portugueses não possuíam plataformas com os transposões
conjugativos CTn5382, CTn5386 ou CTn916, anteriormente associados à transferência
horizontal de pbp5.
A presença de um elevado polimorfismo (traduzindo-se em alterações aminoacídicas
cujas combinações foram designadas de C1 a C12) foi observado entre as sequências de
pbp5 analisadas oriundas de E. faecium que transferiram pbp5. Esta variabilidade pode
refletir a disseminação de um fragmento de DNA portador de pbp5 de elevado tamanho
que evoluiu independentemente em diferentes hospedeiros que estão sob pressão
seletiva. Esta hipótese é sugerida pela variabilidade de sequências de pbp5 localizadas
em regiões com um conteúdo em IS semelhante e pertencendo a linhagens genéticas
próximas (STs de CC17 que são SLV entre eles).
A manutenção do elemento genético portador de pbp5 adquirido na ausência de pressão
seletiva e a sua transferência sob concentrações subinibitórias de ampicilina pode
explicar a rápida expansão da resistência a este antibiótico entre E. faecium nosocomiais
ao longo das últimas décadas. O uso intensivo de ampicilina pode também contribuir
para a disseminação da resistência a outros antibióticos e para a manutenção e evolução
de E. faecium-CC17 em diferentes hospedeiros e nichos ecológicos. In the last decades, E. faecium has become one of the most common nosocomial
pathogens, associated with the disseminated worldwide clonal complex 17 (CC17). The
success of the CC17 subpopulation seems to be related to the acquisition of features
increasing its epidimicity, some of which mostly associated with this CC. They include
antibiotic resistance (e.g. ampicillin and fluoroquinolones) or a greater ability to
colonize and infect different hosts (virulence factors coded by fms, esp hyl, genes
coding for some metabolic pathways). While the occurrence of esp and hyl genes is
variable among E. faecium-CC17, all isolates show resistance to ampicillin. However,
the horizontal spread of the genes codifying for the resistance to this antibiotic (pbp5
gene) remains scarcely explored. Thus, the main objective of this study was to study the
mobilization of pbp5 from E. faecium of different ecological niches and to characterize
the genetic mobile platforms carrying this gene.
The horizontal transfer of ampicillin was detected between wild bacteria from various
sources (hospital and community) and recipient bacteria with different genetic contexts
(pbp5+/pbp5-; different STs). All the wild E. faecium transferring pbp5 gene belonged to
CC17. Ampicillin resistance persisted in wild strains and transconjugants, even in the
absence of selective pressure. The expression of ampicillin resistance was variable
(MIC 8-128mg/L) in the different transconjugants and the cotransfer of resistance to
other antibiotics (e.g. vancomycin, erythromycin, streptomycin) was also detected.
The acquired pbp5 gene was chromosomal located and bands of high and variable sizes
(170-250kb) were detected among wild strains and transconjugants. In pbp5+ receptor
bacteria this horizontal transfer did not seem to replace the natural platform containing
pbp5 in all cases, and rearrangements in the DNA were frequent and diverse among
transconjugants.
The characterization of pbp5 genetic environment and the in silico analysis of sequences
available in genetic databases (GenBank) allowed the identification of five distinct
genetic platforms (I-V), distinguished by the presence of insertion sequences (ISEf1, ISEfa11) genomic fragments (ISEfm1+acetyltransferase+histidinol phosphate
phosphatase) or the conjugative transposon Tn5382. Some of these plataforms (I, II, IV)
were common among E .faecium from different ecological niches, STs and countries. In
contrast to other studies, Portuguese E. faecium did not carry platforms with the
conjugative transposons CTn5382, CTn5386 or CTn916, previously associated with
horizontal transfer of pbp5.
The detection of a high polymorphism (translated in amino acid alterations which
combinations were named C1 to C12) was detected among the aquired pbp5 sequences.
This variability may reflect the dissemination of a large DNA fragment carrying pbp5,
which evolved independently in different hosts that are under selective pressure. This
hypothesis is suggested by the sequence variability of pbp5 sequences located in regions
with a similar IS content and belonging to closed genetic lineages (CC17 STs that are
SLV from each other).
The maintenance of the acquired pbp5-platform in the absence of selective pressure and
their transfer under ampicillin subinibitory concentrations may explain the rapid
expansion of resistance to this antibiotic among nosocomial E. faecium over the past
decades. The intensive use of ampicillin can also contribute to the spread of resistance
to other antibiotics and consequently to the maintenance and evolution of E. faecium-
CC17 in different hosts and ecological niches.
Description
Dissertação apresentada à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Clínica