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Avaliação do efeito da mitomicina C em células uroteliais da bexiga
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Abstract(s)
O cancro da bexiga é a neoplasia maligna mais comum do aparelho urinário, sendo o carcinoma urotelial o tipo histológico mais frequente. Em aproximadamente 70% a 80% dos casos, o tumor é, inicialmente, uma lesão superficial na mucosa da bexiga. Embora sem características histopatológicas de grande agressividade, estes tumores recidivam com frequência e, por vezes, sob formas invasoras. Este facto tem fomentado uma intensa investigação na tentativa de encontrar novas estratégias e alvos terapêuticos, mais eficazes e com menos toxicidade associada. Neste processo de investigação, têm desempenhado um papel fundamental as linhas celulares de tumores de bexiga humana.
Um dos fármacos em investigação é a Mitomicina C (MMC) cujo papel nos atuais esquemas terapêuticos recomendados para os CUB superficiais não está, ainda, bem definido, nomeadamente nos tumores de risco intermédio e alto.
O presente estudo teve como objetivo geral verificar algumas características biológicas da linha celular 5637, considerada uma linha derivada do carcinoma superficial de bexiga humana, após exposição à MMC isolada, bem como em combinação com Everolimus (EVE), Temsirolimus (TEM) e Gemcitabina (GEM).
Para tal, procedeu-se à apreciação do efeito antineoplásico destes fármacos através de três variáveis: avaliação da citotoxicidade celular pelo método de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT), estudo do ciclo celular por citometria de fluxo (CF) e avaliação da percentagem de células em apoptose, também por CF. Dada a diversidade de valores de concentração e tempos de exposição à MMC descritos na literatura foi necessário encontrar um valor adequado para um presente estudo, tendo-se optado por uma concentração de MMC de 1,25µg/ml, durante 1h.
Os resultados obtidos neste estudo revelaram que a MMC isolada tem um efeito antineoplásico evidente, demonstrando uma redução acentuada na viabilidade celular da linha celular 5637. No que diz respeito ao efeito da MMC no ciclo celular, observou-se uma acumulação de células em fase S e aumento da percentagem de células em apoptose.
Em relação à terapia de combinação MMC/EVE e MMC/TEM não se observou um acréscimo do efeito antineoplásico da MMC.
Por outro lado, o efeito antineoplásico da MMC é potenciado quando combinada com a GEM, verificando-se os valores mais baixos de viabilidade celular, com paragem do ciclo celular em G0/G1 e aumento da percentagem de células em apoptose.
Quanto à exposição das células com EVE e TEM isoladamente, observa-se um efeito antineoplásico moderado, com um ligeiro aumento da percentagem de células em apoptose (apenas significativo para a exposição com a EVE).
Relativamente à GEM os resultados são sugestivos de que tem um efeito antineoplásico evidente, com paragem do ciclo celular em G0/G1 sendo potenciada, como referido anteriormente, pela MMC.
Adicionalmente, foi objeto de estudo a linha celular humana de urotélio de bexiga (HCV29) para aferir eventuais alterações no conteúdo de ADN após diferentes tempos de exposição à MMC (1h, 6h, 24h, 48h, e 72h). Neste estudo verificou-se que todas as populações celulares tinham um conteúdo de ADN sobreponível ao controlo (diplóide de ADN), mesmo após 72h de exposição, ou seja, não revelaram alterações do conteúdo de ADN após exposição à MMC. Estes resultados não confirmaram as alterações genéticas descritas na literatura como resultado da ação repetida deste fármaco.
Bladder cancer is the most common malignancy of the urogenital region, with urothelial carcinoma being the most frequent histologic type. Approximately 70%-80% of initial tumours are superficial lesions confined to the bladder mucosa. Although without agressive histopatologic features, these tumours frequently recur and progress to invasive forms. This has led to an intensive research in trying to find new strategies and therapeutic targets, more effective and with lower adverse side effects. In this research process, human bladder tumor cell lines have played a key role.
One of drugs under study is Mitomycin C whose role in current treatment regimens recommended for non-invasive urothelial cell carcinoma is not yet well defined, namely for intermediate and high risk tumours.
The present study aimed to verify some biological characteristics of the 5637 bladder cell line, after Mitomycin C exposure, alone and in combination with Everolimus, Temsirolimus and Gemcitabine. The cell line is accepted as derived from a non-invasive bladder carcinoma.
The anticancer activity of these drugs was measured through three variables: evaluation of cytotoxicity by the method of 3 – [4,5-dimethyl-thiazol –yl] – 2,5-diphenyltetrazolium bromide, and study of the cell cycle and the percentage of cells undergoing apoptosis by flow cytometry. Given the wide range of values of Mitomycin C concentration and exposure time described in the literature, it was first necessary to find a suitable value for this study. A Mitomycin C concentration of 1,25 µg/ml, for 1h, was chosen.
The results of this study revealed that the isolated Mitomycin C has a clear antineoplastic effect, demonstrating a marked reduction in cell viability of 5637 cell line. With respect to cell cycle and apoptosis, a S-phase arrest and increased apoptosis cell fraction, were observed.
Regarding the Mitomycin C/Everolimus and Mitomycin C/Temsirolimus combination therapy no increase antitumor effects was observed compared with Mitomycin C alone.
On the other hand, the antineoplastic effect is enhanced when combined Mitomycin C with Gemcitabine, verifying the lowest values of cell viability, a G0/G1 arrest and increased percentage of cells undergoing apoptosis.
Regarding isolated Everolimus and Temsirolimus exposure, there is a moderate antineoplastic effect, with a slight increase in the percentage of apoptotic cells (only significant with Everolimus).
Regarding Gemcitabine, the results are suggestive of a clear antineoplastic effect in cell cycle with a higher G0/G1 arrest, as mentioned above.
Additionally, changes in the DNA content of normal bladder cell line (HCV29) were evaluated, after different Mitomycin C exposure times (1h, 6h, 24h, 48h and 72h). The results showed that all cell populations studied had a DNA content overlapping the DNA content of the control (diploid DNA), even after 72h of Mitomycin C exposure. No changes in DNA content after Mitomycin C exposure were observed. These results did not confirm the genetic alterations described in the literature as a result of the repeated action of this drug.
Description
Trabalho de Projeto apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Análises Laboratoriais Especializadas, área de especialização em Análise Biomédica
Keywords
Cancro de bexiga Linhas celulares MMC EVE TEM GEM MTT CF Bladder cancer Cell lines Mitomycin C Everolimus Temsirolimus Gemcitabine MTT Flow cytometry