Machado, ElisabeteGonçalves, Teresa Maria Pinto2011-01-192011-10-252011-01-192011-10-252010http://hdl.handle.net/10284/1889Monografia apresentada à Universidade Fernando Pessoa para obtenção do grau de Licenciada em Ciências FarmacêuticasOs antibióticos do grupo dos β-lactâmicos encontram-se entre os mais utilizados no tratamento de infecções causadas por Enterobacteriaceae. Contudo, a produção de beta-lactamases de espectro alargado (ESBLs) nestas bactérias diminui a sua eficácia clínica, restando poucas alternativas terapêuticas, visto que estas bactérias acumulam frequentemente resistência a outras famílias de antibióticos. A produção de ESBLs constitui por isso um dos mecanismos de resistência com maior importância e impacto clínico em Enterobacteriaceae. É essencial detectar no laboratório de microbiologia clínica todos os isolados produtores de ESBLs, assim como proceder à caracterização dos genes que codificam para estas enzimas, de forma a detectar precocemente a emergência de novos genes de resistência e determinar os genes que se encontram mais disseminados entre diferentes espécies bacterianas. Em Portugal a ocorrência, diversidade e relevância clínica das ESBLs são ainda pouco estudadas, existindo apenas relatos esporádicos em hospitais específicos ou estudos efectuados em períodos de tempo relativamente curtos. Mudanças na epidemiologia das ESBLs impõem novas abordagens terapêuticas e de controlo da infecção, justificando a sua vigilância periódica e o presente estudo. Assim, com esta monografia pretendeu-se investigar a ocorrência e a diversidade de genes que codificam para ESBLs (blaESBL) em Enterobacteriaceae isoladas de um hospital Português entre Junho de 2006 e Junho de 2007, comparando com dados de anos anteriores (2002-2004), assim como avaliar a coresistência a antibióticos não β-lactâmicos nos isolados produtores de ESBLs. Para isso, foram utilizados métodos universalmente aceites para a identificação das espécies e avaliação da susceptibilidade a antibióticos. A caracterização de ESBLs incluiu a realização do teste do duplo sinergismo e a identificação de genes blaESBL (blaTEM/blaSHV/blaCTX-M) por PCR e sequenciação. A presença do gene blaOXA-1 e qepA entre os isolados produtores de ESBLs foi também pesquisada por PCR. A expressão de ESBLs foi observada em 5% (81/1486) dos isolados clínicos analisados, os quais foram identificados como Escherichia coli (n=48), Enterobacter cloacae (n=14), Klebsiella pneumoniae (n=10), Klebsiella oxytoca (n=4), Morganella morganii (n=2), Enterobacter asburiae (n=1), Proteus mirabilis (n=1) e Serratia marcescens (n=1). As ESBLs detectadas incluíram representantes de enzimas do tipo TEM (18/81, 22%), SHV (18/81, 22%) e CTX-M (38/81, 47%), correspondendo a oito tipos de ESBLs distintos: TEM (-10, -52, -116), SHV (-12, -64) e CTX-M (-14, -15, -32). As ESBLs mais comuns foram CTX-M-15 (35/81, 43%) identificada em E. coli, e SHV-12 (17/81, 21%) detectada em diferentes espécies. blaOXA-1 e blaTEM-1 foram detectadas na maioria dos isolados produtores de CTX-M-15 (20/32, 63%). Não foi detectada a presença do gene qepA entre as Enterobacteriaceae produtoras de ESBLs. A co-resistência a antibióticos não β-lactâmicos foi frequentemente observada, maioritariamente a tetraciclinas (86%), canamicina (85%), gentamicina (78%), tobramicina (77%), estreptomicina (61%), ciprofloxacina (65%) e sulfonamidas (59%). Conclui-se que ocorreu um aumento na ocorrência e na diversidade de ESBLs e de espécies produtoras de ESBLs no hospital analisado. CTX-M-15 e SHV-12 foram os tipos de ESBLs mais frequentes, tendo sido a espécie E. coli a mais comummente identificada como produtora de ESBLs. A disseminação de clones e plasmídeos que albergam estas ESBLs e que conferem resistência a antibióticos de outras famílias parecem estar a contribuir para este cenário, embora estudos moleculares mais aprofundados devam ser realizados para confirmar o seu envolvimento na situação epidemiológica actual. β-lactams are among the most widely used antibiotics to treat infections caused by Enterobacteriaceae. However, production of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) reduces their clinical efficacy, leaving few therapeutic alternatives, since these bacteria often accumulate resistance genes to antibiotics of other groups. Therefore, production of ESBLs constitutes one of the mechanisms of resistance with greater importance and clinical impact in Enterobacteriaceae. It is essential to detect in the clinical microbiology laboratory all isolates producing ESBLs, as well as to characterize the genes coding for these enzymes, in order to early detect the emergence of new resistance genes and determine the genes that are most widespread among different bacterial species. In Portugal the occurrence, diversity and clinical significance of ESBLs are still poorly studied, with only sporadic reports on individual hospitals or studies in relatively short time periods. Shifts in ESBL-epidemiology might impose new therapeutic approaches and infection control measures, justifying their periodic surveillance and the present study. The main objectives of this monograph were to investigate the occurrence and diversity of genes coding for ESBLs (blaESBL) among Enterobacteriaceae recovered at a Portuguese hospital between June 2006 and June 2007, comparing data with previous years (2002-2004), as well as to evaluate the co-resistance to non-β-lactam antibiotics in ESBL-producing isolates. To accomplish these goals, we used standard methods for species identification and evaluation of susceptibility to antibiotics. The characterization of ESBLs included detection of expression by the double disc synergy test and identification of blaESBL genes (blaTEM/blaSHV/blaCTX-M) by PCR and sequencing. The presence of blaOXA-1 and qepA among ESBL-producing isolates was also investigated by PCR. Expression of ESBLs was observed in 5% (81/1486) of the clinical isolates analyzed, which were identified as Escherichia coli (n=48), Enterobacter cloacae (n=14), Klebsiella pneumoniae (n=10), Klebsiella oxytoca (n=4), Morganella morganii (n=2), Enterobacter asburiae (n=1), Proteus mirabilis (n=1) and Serratia marcescens (n=1). The ESBLs detected included enzymes representatives of TEM- (18/81, 22%), SHV- (18/81 22%) and CTX-M-types (38/81, 47%), corresponding to eight different types of ESBLs: TEM (-10, -52, -116), SHV (-12, -64) and CTX-M (-14, -15, -32). The most common ESBLs were CTX-M-15 (35/81, 43%) identified in E. coli, and SHV-12 (17/81, 21%) detected in different species. blaOXA-1 and blaTEM-1 were detected in almost all isolates producing CTX-M-15 (20/32, 63%). The presence of the gene qepA was not detected among Enterobacteriaceae producing ESBLs. Co-resistance to non-β-lactam antibiotics was frequently observed, mostly to tetracycline (86%), kanamycin (85%), gentamicin (78%), tobramycin (77%), streptomycin (61%), ciprofloxacin (65%) and sulfonamides (59%). It is concluded that happened an increase in the occurrence and diversity of ESBLs and ESBLs-producing species in the hospital analyzed. CTX-M-15 and SHV-12 were the most frequent ESBL types and E. coli was the species most commonly identified as ESBL producer. The spread of clones and plasmids harboring ESBLs and conferring resistance to antibiotics of other groups seems to contribute for this scenario, although more detailed molecular studies should be conducted to confirm their involvement in the current epidemiological situation.porbachelor thesis